Sourakhata TIRERA

A Amazônia abriga uma das maiores diversidades de espécies de vertebrados e invertebrados, que são potenciais reservatórios e vetores de doenças zoonóticas. Nas últimas décadas, essa região neotropical sofreu uma série de epidemias virais associadas a mudanças globais, incluindo modificações antropogênicas (desmatamento, urbanização, introgressão de populações humanas em áreas intactas) e climáticas (aquecimento, mudanças nos padrões de chuva, seca). Essas mudanças têm impacto sobre a distribuição e a densidade das populações de vetores e reservatórios, o que pode levar ao aumento do contato em áreas de interface com populações humanas, resultando em surtos.

A Guiana Francesa tem todas as condições ambientais, demográficas e socioeconômicas necessárias para o desenvolvimento de doenças infecciosas emergentes e reemergentes. É o lar de uma grande variedade de flora e fauna, o que sugere um alto nível de diversidade viral. Apesar disso, a região é uma das menos estudadas em termos de diversidade viral e doenças zoonóticas associadas.

Os roedores foram descritos como reservatórios de muitos patógenos humanos, com mais de 60 identificados, incluindo pelo menos 20 vírus de interesse. Esse grande número está ligado ao seu status de espécie comensal para os seres humanos. Na Guiana Francesa, os roedores foram descritos como reservatórios de vários vírus. Esses incluem o vírus Maripa, um agente etiológico de hantavírus que causa síndromes cardiopulmonares em humanos, e dois arenavírus (os vírus LCMV e Patawa) que podem causar meningite e febres hemorrágicas, respectivamente, nos casos mais graves.

O objetivo desta tese é caracterizar a diversidade viral hospedada por diferentes espécies de roedores presentes em habitats contrastantes (florestas primárias e perturbadas, zonas de savana e áreas periurbanas) e obter uma melhor compreensão de como o ambiente influencia a diversidade de vírus identificados. Entretanto, fazer um inventário tão confiável quanto possível das sequências virais presentes em um viroma pode ser complexo. Os métodos de processamento analítico e de bioinformática podem introduzir vieses na composição dos viromas. Para superar esse problema de inventário, desenvolvemos um pipeline que, quando aplicado a dados metagenômicos, permite a detecção e a atribuição de sequências quiméricas e um ganho no número de sequências virais identificadas.

Em primeiro lugar, uma visão geral dos avanços na pesquisa de doenças infecciosas zoonóticas e transmitidas por vetores na Guiana Francesa destacou a contribuição das ferramentas analíticas mais recentes, baseadas em métodos moleculares e sorológicos de alto rendimento, na caracterização de patógenos, seus hospedeiros e vetores na última década.

Na segunda parte, a diversidade viral foi caracterizada em sete espécies de roedores que evoluíram em quatro tipos de habitat, a fim de explorar como os distúrbios ambientais influenciam essa diversidade. Usando uma abordagem metagenômica, 77.767 sequências virais foram identificadas em amostras de baço, rim e soro. Essas sequências foram atribuídas a 27 famílias virais conhecidas por infectar vertebrados, invertebrados, plantas e amebas. As comparações da diversidade viral em espécies presentes em pelo menos dois habitats mostraram, em geral (com uma espécie mostrando um padrão inverso), uma diversidade maior em habitats de floresta primária em comparação com habitats perturbados. Essas diversidades também foram menores nas áreas periurbanas. A alta riqueza viral também foi observada em áreas de savana. As diferenças na diversidade observada podem ser explicadas pela presença de vírus raros, que geralmente são mais frequentes em florestas primárias e habitats de savana. As mudanças na ecologia e no comportamento dos roedores em um determinado habitat, como as mudanças na dieta em florestas perturbadas e não perturbadas, provavelmente são os principais determinantes da composição viral.

Na terceira parte, discutimos a dificuldade de detectar exaustivamente as sequências virais de um viroma por meio do sequenciamento shotgun. A primeira etapa na caracterização da diversidade viral é produzir um inventário confiável, o que atualmente é feito pela atribuição taxonômica das sequências do viroma. As abordagens analíticas (concentração de partículas virais, método de extração, amplificações aleatórias, método de sequenciamento) e bioinformáticas (para a produção de contigs que representam um viroma) introduzem vieses, como a representação excessiva de determinados genomas e a formação de sequências quiméricas compostas por diferentes organismos. Para resolver esse problema, desenvolvemos um pipeline chamado "d-chimer" que permite a atribuição taxonômica de sequências pós-montagem, otimizando a detecção viral em estudos de virômica, inclusive em contigs quiméricos. Essa abordagem é baseada em duas etapas. Primeiro, um filtro leva em conta a possibilidade da presença de sequências quiméricas na saída do BLAST, ilustrada por diferentes frações da consulta alinhadas com diferentes sequências de referência. Em seguida, considerando que nem todas as partes das sequências são detectadas nesse processo, as áreas descobertas são cortadas, armazenadas e usadas como entrada para um novo ciclo BLAST-filtro, de forma recursiva (reciclagem). O uso do d-chimer em dois estágios sucessivos do BLASTn e do BLASTx reduz significativamente o tempo total de computação e permite uma melhor detecção de fragmentos virais, com um impacto positivo na riqueza detectada em comparação com a abordagem "best-hit". Aplicamos o d-chimer a dados montados de vírus de aves e roedores. Em comparação com uma abordagem de melhor acerto em uma etapa, ambos os conjuntos de dados mostram um aumento significativo no número de contigs virais e fragmentos de contigs atribuídos. Esse aumento no número de sequências virais também revelou um aumento na riqueza viral em nível de espécie e gênero e, em menor grau, em nível de família.

Todos os resultados obtidos durante esta tese mostram que os componentes ambientais são fatores-chave na diversidade viral. Em conjunto com o desenvolvimento de ferramentas de detecção molecular de alto rendimento, as análises da diversidade viral em reservatórios animais devem nos permitir estudar melhor a ecologia dos vírus e seus determinantes. A comparação de dados metagenômicos virais obtidos de reservatórios animais, vetores e seres humanos deve esclarecer os vínculos com as zoonoses na Guiana Francesa e em outros lugares da Amazônia, em ecossistemas cuja alta diversidade viral ainda não foi compreendida.

A Amazônia abriga uma das maiores diversidades de espécies de vertebrados e invertebrados, potencialmente reservatórios e vetores de doenças zoonóticas. Nas últimas décadas, essa região neotropical passou por inúmeras epidemias virais associadas a mudanças globais, incluindo modificações antropogênicas (desmatamento, urbanização, introgressão de populações humanas em áreas intactas) e climáticas (aquecimento, mudanças no regime de chuvas, secas). Essas mudanças afetam a distribuição e as densidades das populações de vetores e reservatórios, o que pode levar a um maior contato nas áreas de interface com as populações humanas e, portanto, levar à emergência.

A Guiana Francesa abriga todas as condições ambientais, demográficas e socioeconômicas que são favoráveis ao surgimento e reaparecimento de doenças infecciosas. Esse departamento francês abriga uma grande diversidade de flora e fauna, o que pode refletir uma diversidade viral significativa. No entanto, a região é uma das menos estudadas em termos de diversidade viral e doenças zoonóticas associadas.

Os roedores foram descritos como reservatórios de vários patógenos humanos (mais de 60 identificados), incluindo pelo menos 20 vírus de interesse. Esse grande número está associado ao seu status de espécie comensal dos seres humanos. Na Guiana Francesa, os roedores foram descritos como reservatórios de vários vírus. Entre eles, podemos mencionar o vírus Maripa, um agente etiológico de hantavírus que induz síndromes cardiopulmonares em humanos, e dois arenavírus (LCMV e vírus Patawa) que podem causar, respectivamente, meningite e febres hemorrágicas nos casos mais graves.

O objetivo desta tese é caracterizar a diversidade viral hospedada em diferentes espécies de roedores presentes em habitats contrastantes (florestas primárias e perturbadas, savanas e áreas periurbanas) e entender melhor como o ambiente influencia a diversidade dos vírus identificados. Entretanto, fazer o inventário mais confiável das sequências virais presentes em um viroma pode ser complexo. De fato, os métodos analíticos e o processamento de bioinformática podem introduzir vieses na composição dos viromas. Para superar esse problema de inventário, desenvolvemos um pipeline que, quando aplicado a dados metagenômicos, permite a detecção e a atribuição de sequências quiméricas e um ganho no número de sequências virais identificadas.

Em primeiro lugar, uma síntese dos avanços mais recentes da pesquisa sobre doenças infecciosas zoonóticas e transmitidas por vetores na Guiana Francesa destacou a contribuição das ferramentas analíticas mais recentes, com base em métodos moleculares e sorológicos de alto rendimento, na caracterização de patógenos, seus hospedeiros e vetores na última década.

Em segundo lugar, a diversidade viral foi caracterizada em sete espécies de roedores que evoluíram em quatro tipos de habitats, a fim de explorar como as perturbações ambientais influenciam essa diversidade. Usando uma abordagem metagenômica, 77.767 sequências virais foram identificadas em amostras de baço, rim e soro. Essas sequências foram atribuídas a 27 famílias virais conhecidas por infectar vertebrados, invertebrados, plantas e amebas. As comparações da diversidade viral em espécies presentes em pelo menos dois habitats mostraram, em geral, uma diversidade maior em habitats de floresta primária em comparação com habitats perturbados. Essas diversidades também são menores nas áreas periurbanas. A alta riqueza viral também é observada em áreas de savana. As diferenças de diversidade observadas podem ser explicadas pela presença de vírus raros que, em geral, são mais frequentes em habitats de floresta primária e savana. Além disso, as mudanças na ecologia e no comportamento dos roedores em um determinado habitat, como mudanças na dieta em florestas perturbadas e não perturbadas, devem ser os principais determinantes da composição viral.

Em terceiro lugar, nos concentramos na dificuldade de detectar exaustivamente as sequências virais de um viroma por meio do sequenciamento shotgun. A primeira etapa na caracterização da diversidade viral é produzir um inventário confiável, o que atualmente é feito pela atribuição taxonômica de sequências de viroma. No entanto, as abordagens analíticas (concentração de partículas virais, método de extração, amplificações aleatórias, método de sequenciamento) e de bioinformática (para a produção de contigs que representam um viroma) introduzem vieses, como a representação excessiva de determinados genomas e a formação de sequências quiméricas compostas por diferentes organismos. Para resolver esse problema, desenvolvemos um pipeline chamado "d-chimer" que permite a atribuição taxonômica de sequências pós-montagem para otimizar a detecção viral em estudos de virômica, inclusive em contigs quiméricos. Essa abordagem é baseada em duas etapas. Primeiro, um filtro que leva em conta a probabilidade da presença de sequências quiméricas nos resultados do BLAST expressos por diferentes frações da consulta alinhadas com diferentes sequências de referência. Em seguida, considerando que nem todas as partes das sequências são detectadas nesse processo de uma só vez, as áreas descobertas são cortadas, armazenadas e usadas como entrada para um novo ciclo BLAST - filtro, de forma recursiva (reciclagem). O uso do d-chimer em duas etapas sucessivas do BLASTn e do BLASTx reduz significativamente o tempo total de computação, além de permitir uma melhor detecção de fragmentos virais com um impacto positivo na riqueza em comparação com a abordagem "best-hit". Aplicamos o d-chimer para reunir dados virais de aves e roedores. Em comparação com a abordagem "best-hit" de uma etapa, ambos os conjuntos de dados mostram um aumento significativo no número de contigs virais e fragmentos de contigs atribuídos. Esse ganho no número de sequências virais também revelou um aumento na riqueza viral no nível de espécie e gênero e, em menor grau, no nível de família.

Todos os resultados obtidos durante esta tese mostram que os componentes ambientais são fatores-chave na diversidade viral. Combinada com o desenvolvimento de ferramentas de detecção molecular de alto rendimento, a análise da diversidade viral em reservatórios animais deve nos permitir estudar melhor a ecologia dos vírus e seus determinantes. A comparação de dados metagenômicos virais obtidos em reservatórios animais, vetores e seres humanos deve lançar luz sobre as ligações com zoonoses na Guiana Francesa e em outros ecossistemas amazônicos, onde uma parte significativa da diversidade viral ainda precisa ser descoberta e compreendida.