Lise MUSSET

Trois axes structurent les activité de recherche sur le paludisme que je conduis depuis vingt ans: i) comprendre les mécanismes de résistance des plasmodies aux antipaludiques d’intérêt et leur évolution, ii) élargir les connaissances sur P. vivax, l’espèce aujourd’hui prédominante en Amazonie et, iii) conduire des projets de recherche opérationnelle indispensables à l’optimisation de la prise en charge et au contrôle du paludisme dans la région. La recherche en santé publique que je conduis se veut pluridisciplinaire, transversale et translationnelle, du malade au laboratoire en passant par les lieux de prise en charge et les zones de transmission.

Ma contribution à la compréhension des mécanismes de résistance de P. falciparum aux antipaludiques a débuté au moment de mon doctorat et se poursuit toujours. Au début des années 2000, alors que l’atovaquone-proguanil venait d’être autorisée et commercialisée en France, l’ensemble de mes travaux de doctorat ont permis de montrer que les parasites qui circulaient en Afrique de l’ouest étaient sensibles à l’atovaquone. Nous avons cependant mis en évidence l’émergence de novo de parasites résistants, chez les patients, à partir d’une population sensible initialement transmise par le moustique (Musset, Le Bras et al. 2007). Cette sélection de la résistance, de novo, était théoriquement possible chez tous les patients puisque tous étaient au moins porteurs d’un parasite mutant, résistant, avant le début de leur traitement. Pourtant, l’échec thérapeutique n’était pas systématique. Ces travaux ont souligné l’importance des concentrations initiales plasmatiques en molécule qui ont un rôle non négligeable dans l’émergence/sélection des parasites résistants à un antipaludique. Ainsi l’utilisation d’une telle association en zone d’endémie était exclue car trop exposée à la résistance. L’originalité de ce travail était également d’avoir mis en évidence ce phénomène, en amont de la sélection/dispersion des parasites résistants. Jusque-là, les travaux visant à comprendre l’histoire évolutive de la résistance, à la chloroquine et la sulfadoxine-pyriméthamine, avaient été réalisés de manière rétrospective faute d’outils de biologie moléculaire disponibles.

Au cours de mon postdoctorat, j’ai commencé à étudier l’implication du gène pfcrt dans la résistance aux amino-4-quinoléines une classe d’antipaludiques regroupant de nombreuses molécules (chloroquine, méfloquine, pipéraquine, luméfantrine…). Après avoir déterminé le chemin évolutif pris par les parasites pour acquérir les quatre mutations requises pour être résistant à la chloroquine, je me suis intéressée à ce gène en Guyane de manière à mieux comprendre pourquoi certains parasites étaient sensibles à la chloroquine alors qu’ils étaient porteurs des mutations de résistance au niveau de pfcrt. Les remplacements alléliques et le séquençage génome entier nous ont permis de mettre en évidence une mutation additionnelle, pfcrt C350R, responsable de la réversion de la résistance à la chloroquine (Pelleau, Moss et al. 2015). Il s’agissait là de la première description d’un phénomène de réversion chez les plasmodies. Une étude rétrospective a montré que cette mutation est apparue en 2003 puis a rapidement diffusé à l’ensemble de la population parasitaire guyanaise. Elle était en 2015 présente de manière majoritaire et spécifique dans tous les pays du plateau des Guyanes. Ayant débuté ce projet dans le simple but d’approfondir nos connaissances sur le gène pfcrt, sans intérêt en santé publique puisque la chloroquine n’était déjà plus utilisée pour traiter P. falciparum, les résultats nous orientent aujourd’hui vers d’autres molécules, de la même famille, mais qui sont, elles, d’actualités et utilisées en thérapeutique.

Il y a quatre ans, alors que les associations à base de dérivés de l’artémisinine étaient recommandées depuis plus de 15 ans, des signaux de résistance étaient publiées au Suriname et au Guyana. Nous avons donc débuté un projet sur l’épidémiologie et la compréhension de la résistance aux artémisinines en Amazonie. A ce jour, ce projet nous a permis de démontrer : i) que la mutation C580Y dans le gène pfk13 a été sélectionnée au Guyana indépendamment des sélections asiatiques, ii) qu’elle est effectivement responsable d’un phénotype de résistance chez les parasites amazoniens, iii) qu’elle se transmet actuellement sous la forme d’un clone (Mathieu, Cox et al. 2020). Sa présence semble aujourd’hui limitée à ce pays de la région est amazonienne. Elle circule à bas bruit et a peu dispersé en six ans. Des tests de compétition de croissance ont mis en évidence un impact négatif de la présence de mutation sur les capacités de multiplication des parasites qui pourrait expliquer cette dynamique.

Depuis mon arrivée en Guyane, je m’attache également à élargir les connaissances sur P. vivax puisqu’en 2005, une inversion des prévalences s’est produite et cette espèce est devenue l’espèce majoritaire en Guyane. Après avoir étudié les génotypes circulant des gènes orthologues, pvdhfr, pvdhps et pvmdr1, nous avons, en lien avec l’Hôpital ce Cayenne, analysé la réponse thérapeutique des patients atteints de P. vivax traités par chloroquine, entre mars 2009 et octobre 2015, selon le protocole de l’OMS. L’efficacité thérapeutique de la chloroquine a été évaluée à 95% grâce au suivi de 172 patients (Musset, Heugas et al. 2019). Deux cas de résistance ont été identifiés sans pour autant nécessiter d’adapter les recommandations thérapeutiques. Le génotype pvmdr1 n’étant finalement pas informatif, l’identification d’un marqueur moléculaire de résistance de P. vivax à la chloroquine reste une priorité pour la surveiller plus facilement. Pour lutter efficacement contre le paludisme, il est nécessaire d’avoir des traitements efficaces mais également des outils de diagnostic performants. Aussi très régulièrement je mets au point de nouvelles méthodes de diagnostic (exemple : PCR en temps réel diagnostique d’espèce) ou évalue de nouveaux kits commerciaux. C’est ainsi qu’en 2010, nous avons pu définir que le TDR SD Malaria Ag P.f/Pan® était plus performant et adapté au diagnostic du paludisme en Guyane que le TDR Optimal® utilisé jusque-là (Trouvay, Palazon et al. 2013). Il a ainsi été déployé et l’est toujours actuellement dans les Centres Délocalisés de Prévention et de Soins.

Au-delà du diagnostic et du traitement, pour lutter contre le paludisme et l’éliminer lorsque le niveau de transmission a bien diminué, il faut localiser les derniers cas et identifier les porteurs. C’est autour de ces aspects, caractérisation des zones de transmission et éducation de la population, que je développe, depuis 2010, un certain nombre de projets de recherche opérationnelle, en collaboration. ORPAL a permis de caractériser les zones de transmission du paludisme en sites orpaillées, et de montrer que l’automédication dans ces zones était importante et pouvait fragiliser les molécules utilisées (Douine, Lazrek et al. 2018). PALUSTOP a également sur la commune de Saint Georges de l’Oyapock montré qu’une approche de dépistage actif par PCR suivi d’un traitement systématique des personnes positives permettait de réduire le niveau de transmission dans les quartiers les plus impactés. Ces quartiers les plus touchés par le paludisme sont ceux situés le plus loin du centre de santé et où les habitants attendent quelques jours avant de se déplacer pour un diagnostic. Durant cette période, ils participent donc activement à la transmission de la maladie (Mosnier, Roux et al. 2020).

Mes perspectives sont nombreuses et s’inscrivent dans ces mêmes axes. Elles visent à poursuivre les travaux engagés sur les thématiques les plus compétitives et les plus prometteuses. Tout cela dans l’intérêt des habitants de nos zones à risque et avec un réseau international de collaborateurs qui nous permet d’approfondir nos questions et d’augmenter l’impact de nos résultats.

My research activities on malaria I have been carrying out for twenty years follow three axes: i) understanding the resistance mechanisms of parasites to the antimalarial drugs and their evolution, ii) expanding our knowledge of P. vivax, the predominant species in Amazonia and, iii) conducting operational research projects to optimize diagnosis, treatment and control of malaria in the region. The research in public health that I conduct aims to be multidisciplinary, transversal and translational, from the patient to the laboratory, including health centers and transmission areas.

My contribution in understanding the resistance mechanisms of P. falciparum to antimalarial drugs began at the time of my doctorate and is still ongoing. In the early 2000s, when atovaquone-proguanil had just been approved and marketed in France, we demonstated that parasites circulating in West Africa were sensitive to atovaquone. However, we identified de novo emergence of resistant parasites in patients, from an initially susceptible parasite population transmitted by mosquitoes (Musset, Le Bras et al. 2007). This de novo selection of resistance was theoretically possible in all patients since all of them carried at least one mutant parasite before treatment initiation. However, treatment failure was not systematic. This work has underlined the importance of the initial plasma concentrations of the molecule, which have a significant role in the emergence / selection of parasites resistant to an antimalarial drug. The use of such a combination in an endemic area was therefore excluded because it was too exposed to resistance selection. The originality of this work was also to have highlighted this phenomenon, upstream of the selection / dispersal of resistant parasites. Until then, work aimed at understanding the evolutionary history of resistance, to chloroquine or sulfadoxine-pyrimethamine for example, retrospectively because of the lack of molecular biology tools.

During my postdoctoral fellowship, I began to study the involvement of the pfcrt gene in resistance to 4- aminoquinolines, a class of antimalarial drugs comprising many molecules (chloroquine, mefloquine, piperaquine, lumefantrine, etc…). After having determined the evolutionary path taken by the parasites to acquire the four mutations required to be resistant to chloroquine, I looked at this gene in parasites from French Guiana in order to better understand why certain parasites were sensitive to chloroquine despite a pfcrt gene including the mutations for resistance. Allelic replacement and whole genome sequencing allowed us to identify an additional mutation, pfcrt C350R, responsible for a reversion of resistance to chloroquine (Pelleau, Moss et al. 2015). This was the first description of a reversion phenomenon in plasmodia. A retrospective study showed that this mutation appeared in 2003 and then, quickly spread to the entire population of parasites in French Guiana. In 2015, it was present and predominant in all the countries of the Guiana Shield. Having started this project with the aim of strenghtening our knowledge of the pfcrt gene, without public health interest since chloroquine was no longer used to treat P. falciparum, the results are now directing us to other molecules of the same family actually in use.

Four years ago while artemisinin combination therapies were deployed for 10 years, signals for resistance were published in Suriname and Guyana. We therefore started a project to characterize resistance to artemisinin derivatives in Amazonia. To date, this project has enabled us to demonstrate: i) that the pfk13 C580Y mutation was selected in Guyana independently from Souteast Asia, ii) that it is responsible for a resistant phenotype in Amazonian parasites and, iii) that it is currently transmitted as a clone (Mathieu, Cox et al. 2020). However, its transmission seems to be limited to this country of the Eastern Amazon region. It circulates at a low transmission level and poorly dispersed in six years. Growth competition assays have shown a negative impact of the presence of this mutation on the multiplication capacities of the parasites which could explain this dynamic.

Since my arrival in French Guiana, I also contribute to expand our knowledge of P. vivax. In fact, since 2005, this species is predominant in French Guiana. After having studied the orthologous genes for resistance, pvdhfr, pvdhps and pvmdr1, in collaboration with the Cayenne Hospital, we evaluated the therapeutic response of patients infected by P. vivax treated with chloroquine. Between March 2009 and October 2015, according to WHO protocol, the therapeutic efficacy of chloroquine has been evaluated at 95% through the follow-up of 172 patients (Musset, Heugas et al. 2019). Two cases of resistance have been identified without requiring any adaptation of the treatment recommendations. As the pvmdr1 genotype is ultimately not informative, the identification of a molecular marker of P. vivax resistance to chloroquine remains a priority to monitor it more easily.

To control malaria, effective treatments are required as well as powerful diagnostic tools. Also, regularly, I develop new diagnostic methods (example: real-time PCR for species diagnosis) or evaluate new commercial kits. In 2010, we were able to define that the rapid diagnostic test (RDT) SD Malaria Ag Pf / Pan® was more performant for malaria diagnosis in health centers than the Optimal® RDT used until then (Trouvay, Palazon et al. 2013 ). Thus, it has been deployed and is still currently in used in the health centers.

Beyond diagnosis and treatment, to control and even eliminate malaria when its transmission level has decreased, we must locate the last cases and identify carriers. It is around these aspects, characterization of transmission areas and education of the population, I have been developing, since 2010, a number of operational research projects. With the ORPAL project, we were able to characterize malaria transmission in gold-mining sites, and show that self-medication in these areas was important and could weaken antimalarial drugs (Douine, Lazrek et al. 2018). In Saint Georges de l’Oyapock, bordering Brazil, PALUSTOP deployed an approach of active screening by PCR followed by systematic treatment of positive people. It reduced the level of transmission in the most affected neighborhoods. These neighborhoods are those located furthest from the health center. In these places, inhabitants generally wait a few days before looking for diagnosis. Therefore, during this period, they actively participate in the transmission of the disease (Mosnier, Roux et al. 2020).

My research perspectives are numerous, as a continuation of the same axes. They aim to continue the work started on the most competitive and promising themes. All this in the interest of the inhabitants of our risk areas and with an international network of collaborators who allow us to deepen our questions and increase the impact of our results.

Bibliographie : les sept publications les plus représentatives de mes activités de recherche

Douine, M., Y. Lazrek, D. Blanchet, S. Pelleau, R. Chanlin, F. Corlin, L. Hureau, B. Volney, H. Hiwat, S. Vreden, F. Djossou, M. Demar, M. Nacher and L. Musset (2018). « Predictors of antimalarial self-medication in illegal gold miners in French Guiana: a pathway towards artemisinin resistance. » J Antimicrob Chemother 73(1): 231-239.

Mathieu, L. C., H. Cox, A. M. Early, S. Mok, Y. Lazrek, J. C. Paquet, M. P. Ade, N. W. Lucchi, Q. Grant, V. Udhayakumar, J. S. Alexandre, M. Demar, P. Ringwald, D. E. Neafsey, D. A. Fidock and L. Musset (2020). « Local emergence in Amazonia of Plasmodium falciparum k13 C580Y mutants associated with in vitro artemisinin resistance. » Elife 9.

Mosnier, E., E. Roux, C. Cropet, Y. Lazrek, O. Moriceau, M. Gaillet, L. Mathieu, M. Nacher, M. Demar, G. Odonne, M. Douine, C. Michaud, S. Pelleau, F. Djossou and L. Musset (2020). « Prevalence of Plasmodium spp. in the Amazonian Border Context (French Guiana-Brazil): Associated Factors and Spatial Distribution. » Am J Trop Med Hyg 102(1): 130- 141.

Musset, L., C. Heugas, R. Naldjinan, D. Blanchet, P. Houze, P. Abboud, B. Volney, G. Walter, Y. Lazrek, L. Epelboin, S. Pelleau, P. Ringwald, E. Legrand, M. Demar and F. Djossou (2019). « Emergence of Plasmodium vivax Resistance to Chloroquine in French Guiana. » Antimicrob Agents Chemother 63(11).

Musset, L., J. Le Bras and J. Clain (2007). « Parallel evolution of adaptive mutations in Plasmodium falciparum mitochondrial DNA during atovaquone-proguanil treatment. » Mol Biol Evol 24(8): 1582-1585.

Pelleau, S., E. L. Moss, S. K. Dhingra, B. Volney, J. Casteras, S. J. Gabryszewski, S. K. Volkman, D. F. Wirth, E. Legrand, D. A. Fidock, D. E. Neafsey and L. Musset (2015). « Adaptive evolution of malaria parasites in French Guiana: Reversal of chloroquine resistance by acquisition of a mutation in pfcrt. » Proc Natl Acad Sci U S A 112(37): 11672-11677.

Trouvay, M., G. Palazon, F. Berger, B. Volney, D. Blanchet, E. Faway, D. Donato, E. Legrand, B. Carme and L. Musset (2013). « High Performance of Histidine-Rich Protein 2 Based Rapid Diagnostic Tests in French Guiana are Explained by the Absence of pfhrp2 Gene Deletion in P. falciparum. » PLoS ONE 8(9): e74269.

Bibliography: seven publications the most representative of my research activities

Douine, M., Y. Lazrek, D. Blanchet, S. Pelleau, R. Chanlin, F. Corlin, L. Hureau, B. Volney, H. Hiwat, S. Vreden, F. Djossou, M. Demar, M. Nacher and L. Musset (2018). « Predictors of antimalarial self-medication in illegal gold miners in French Guiana: a pathway towards artemisinin resistance. » J Antimicrob Chemother 73(1): 231-239.

Mathieu, L. C., H. Cox, A. M. Early, S. Mok, Y. Lazrek, J. C. Paquet, M. P. Ade, N. W. Lucchi, Q. Grant, V. Udhayakumar, J. S. Alexandre, M. Demar, P. Ringwald, D. E. Neafsey, D. A. Fidock and L. Musset (2020). « Local emergence in Amazonia of Plasmodium falciparum k13 C580Y mutants associated with in vitro artemisinin resistance. » Elife 9.

Mosnier, E., E. Roux, C. Cropet, Y. Lazrek, O. Moriceau, M. Gaillet, L. Mathieu, M. Nacher, M. Demar, G. Odonne, M. Douine, C. Michaud, S. Pelleau, F. Djossou and L. Musset (2020). « Prevalence of Plasmodium spp. in the Amazonian Border Context (French Guiana-Brazil): Associated Factors and Spatial Distribution. » Am J Trop Med Hyg 102(1): 130- 141.

Musset, L., C. Heugas, R. Naldjinan, D. Blanchet, P. Houze, P. Abboud, B. Volney, G. Walter, Y. Lazrek, L. Epelboin, S. Pelleau, P. Ringwald, E. Legrand, M. Demar and F. Djossou (2019). « Emergence of Plasmodium vivax Resistance to Chloroquine in French Guiana. » Antimicrob Agents Chemother 63(11).

Musset, L., J. Le Bras and J. Clain (2007). « Parallel evolution of adaptive mutations in Plasmodium falciparum mitochondrial DNA during atovaquone-proguanil treatment. » Mol Biol Evol 24(8): 1582-1585.

Pelleau, S., E. L. Moss, S. K. Dhingra, B. Volney, J. Casteras, S. J. Gabryszewski, S. K. Volkman, D. F. Wirth, E. Legrand, D. A. Fidock, D. E. Neafsey and L. Musset (2015). « Adaptive evolution of malaria parasites in French Guiana: Reversal of chloroquine resistance by acquisition of a mutation in pfcrt. » Proc Natl Acad Sci U S A 112(37): 11672-11677.
Trouvay, M., G. Palazon, F. Berger, B. Volney, D. Blanchet, E. Faway, D. Donato, E. Legrand, B. Carme and L. Musset (2013). « High Performance of Histidine-Rich Protein 2 Based Rapid Diagnostic Tests in French Guiana are Explained by the Absence of pfhrp2 Gene Deletion in P. falciparum. » PLoS ONE 8(9): e74269.