Sourakhata TIRERA

L’Amazonie abrite l’une des plus grandes diversités d’espèces de vertébrés et invertébrés, potentiellement réservoirs et vecteurs de maladies zoonotiques. Au cours des dernières décennies, cette région néotropicale a connu de nombreuses épidémies virales associées aux changements globaux, incluant aussi bien des modifications d’origine anthropique (déforestation, urbanisation, introgression de populations humaines dans des zones intactes) que climatiques (réchauffement, changement des régimes de pluie, sécheresse). Ces modifications impactent les distributions et les densités des populations vectrices et réservoirs, pouvant induire des contacts accrus dans les zones d’interface avec les populations humaines et conduire ainsi à des émergences.

La Guyane rassemble sur son territoire toutes les conditions, environnementales, démographiques et socio-économiques favorables au développement de maladies infectieuses émergentes et réémergentes. Elle héberge une grande diversité floristique et faunistique, laissant supposer une diversité virale importante. Malgré cela, cette région est l’une des moins étudiées en termes de diversité virale et de maladies d’origine zoonotique associées.

Les rongeurs ont été décrits comme réservoirs de nombreux pathogènes humains, avec plus de 60 identifiés, dont au moins 20 virus d’intérêt. Ce nombre important est à associer à leur statut d’espèces commensales de l’homme. En Guyane, les rongeurs ont été décrits comme réservoirs de différents virus. Parmi eux, on peut citer le virus Maripa, agent étiologique d’hantaviroses qui induisent des syndromes cardio-pulmonaires chez l’homme, et deux arénavirus (les virus LCMV et Patawa) qui peuvent respectivement provoquer des méningites et des fièvres hémorragiques dans les cas les plus sévères.

L’objectif de cette thèse est de caractériser la diversité virale hébergée chez différentes espèces de rongeurs présents dans des habitats contrastés (forêts primaires et perturbées, zone de savanes et zones péri-urbaines) et de mieux comprendre comment l’environnement influence la diversité des virus identifiés. Cependant, réaliser un inventaire, le plus fiable possible, des séquences virales présentes dans un virome peut s’avérer complexe. En effet, les méthodes analytiques et de traitements bioinformatiques peuvent introduire des biais dans la composition des viromes. Afin de pallier ce problème d’inventaire, nous avons développé un pipeline qui, appliqué aux données de métagénomiques, permet la détection et l’assignation de séquences chimériques et un gain dans le nombre de séquences virales identifiées.

En premier lieu, une synthèse des avancées des recherches sur les maladies infectieuses zoonotiques et vectorielles en Guyane a permis de souligner l’apport des derniers outils analytiques, basés sur des méthodes moléculaires et sérologiques à haut débit dans la caractérisation des agents pathogènes, leurs hôtes et vecteurs au cours de la dernière décennie.

Dans une deuxième partie, la diversité virale a été caractérisée chez sept espèces de rongeurs évoluant dans quatre types d’habitats afin d’explorer comment les perturbations environnementales influencent cette diversité. Grâce à une approche métagénomique, 77. 767 séquences virales ont été identifiées à partir d’échantillons de rate, de rein et de sérum. Ces séquences ont été attribuées à 27 familles virales connues pour infecter des vertébrés, des invertébrés, des plantes et des amibes. Les comparaisons des diversités virales chez les espèces présentes dans au moins deux habitats ont montré de manière globale (une espèce montrant un schéma inverse) une diversité plus grande dans les habitats de forêt primaire en comparaison des habitats perturbés. Ces diversités sont également plus faibles dans les zones périurbaines. Une richesse virale importante est également observée dans les zones de savane. Les différences de diversités observées peuvent être expliquées par la présence des virus rares qui sont généralement plus fréquents dans les forêts primaires et les habitats de savane. Les changements dans l’écologie et le comportement des rongeurs, dans un habitat donné, tels que les modifications du régime alimentaire dans les forêts perturbées par rapport aux forêts intactes, sont vraisemblablement des déterminants majeurs de la composition virale.

En troisième partie, nous abordons la difficulté de détecter de manière exhaustive les séquences virales d’un virome réalisé par séquençage shotgun. La première étape pour la caractérisation de la diversité virale est de produire un inventaire fiable, qui, actuellement, se fait par assignation taxonomique des séquences de viromes. Les démarches analytiques (concentration en particules virales, méthode extraction, amplifications aléatoires, méthode de séquençage) et bioinformatiques (pour la production de contigs qui représentent un virome), introduisent des biais comme une sur-représentation de certains génomes ainsi que la formation de séquences chimériques composées de différents organismes. Afin de répondre à cette problématique, nous avons développé un pipeline appelé « d-chimer » qui permet une assignation taxonomique des séquences post-assemblage, optimisant la détection virale dans les études viromiques, y compris dans les contigs chimériques. Cette approche repose sur deux étapes. Tout d’abord, un filtre prend en compte la possibilité de présence de séquences chimériques dans les sorties BLAST, illustrées par différentes fractions de la requête s’alignant avec différentes séquences de référence. Ensuite, considérant que toutes les parties de séquences ne sont pas détectées dans ce processus, les zones non couvertes sont coupées, stockées et servent d’entrée pour un nouveau cycle BLAST – filtre, de manière récursive (recyclage). L’utilisation de d-chimer en deux étapes successives de BLASTn et BLASTx permet de réduire significativement le temps de calcul global, tout en permettant une meilleure détection des fragments viraux avec un impact positif sur la richesse détectée par rapport à l’approche « best-hit ». Nous avons appliqué d-chimer à des données assemblées de viromes d’oiseaux et de rongeurs. Par rapport à une approche « best-hit » en une étape, les deux jeux de données montrent une augmentation significative du nombre de contigs et de fragments de contigs viraux attribués. Ce gain en nombre de séquences virales a également révélé une augmentation de la richesse virale au niveau des espèces et des genres et, dans une moindre mesure, au niveau des familles.

L’ensemble des résultats obtenus au cours de cette thèse montre que les composantes environnementales sont des facteurs clés des diversités virales. Associées aux développements des outils de détection moléculaires à haut débit, les analyses de diversités virales chez les réservoirs animaux devraient permettre de mieux étudier l’écologie des virus et leurs déterminants. La comparaison des données de métagénomique virale obtenues chez les réservoirs animaux, les vecteurs et chez l’homme, devrait permettre d’éclairer les liens avec les zoonoses en Guyane, et ailleurs en Amazonie, dans des écosystèmes dont la diversité virale importante reste à appréhender.

Amazonia hosts one of the greatest diversity of vertebrate and invertebrate species, potentially reservoirs and vectors of zoonotic diseases. In the last decades, this neotropical region has experienced numerous viral epidemics associated with global changes, including both anthropogenic (deforestation, urbanisation, introgression of human populations into intact areas) and climatic modifications (warming, changes in rains regime, drought). These changes impact the distribution and densities of vector and reservoir populations, which can lead to increased contact at the interface areas with human populations and thus lead to emergence.

French Guiana harbours all the environmental, demographic, and socio-economic conditions that are favourable to the emergence and re-emergences of infectious diseases. This French department hosts a great diversity of flora and fauna, which may reflect a significant viral diversity. Nevertheless, the region is one of the least studied in terms of viral diversity and associated zoonotic diseases.

Rodents have been described as reservoirs of numerous human pathogens (more than 60 identified), including at least 20 viruses of interest. This large number is associated with their status as commensal specie of humans. In French Guiana, rodents have been described as reservoirs of various viruses. Among them, we can mention the Maripa virus, an etiological agent of hantaviruses that induce cardiopulmonary syndromes in humans, and two arenaviruses (LCMV and Patawa viruses) that can respectively cause meningitis and haemorrhagic fevers in the most severe cases.

The objective of this thesis is to characterise the viral diversity hosted in different rodent species present in contrasting habitats (primary and disturbed forests, savannah, and peri-urban areas) and to better understand how the environment influences the diversity of the identified viruses. However, making the most reliable inventory of the viral sequences present in a virome can be complex. Indeed, analytical methods and bioinformatics processing can introduce biases in the composition of viromes. In order to overcome this inventory problem, we have developed a pipeline, which, when applied to metagenomic data, allows the detection and assignment of chimeric sequences and a gain in the number of viral sequences identified.

Firstly, a synthesis of the most recent research advances on zoonotic and vector-borne infectious diseases in French Guiana highlighted the contribution of the latest analytical tools, based on high-throughput molecular and serological methods, in the characterisation of pathogens, their hosts and vectors over the last decade.

Second, viral diversity was characterised in seven rodent species evolving in four types of habitats in order to explore how environmental perturbations influence this diversity. Using a metagenomic approach, 77,767 viral sequences were identified from spleen, kidney and serum samples. These sequences were assigned to 27 viral families known to infect vertebrates, invertebrates, plants and amoeba. Comparisons of viral diversity in species present in at least two habitats showed overall a higher diversity in primary forest habitats compared to disturbed habitats. These diversities are also lower in peri-urban areas. High viral richness is also observed in savannah areas. The differences in diversity observed can be explained by the presence of rare viruses that are generally more frequent in primary forest and savannah habitats. In addition, changes in the ecology and behaviour of rodents in a given habitat, such as changes in diet in disturbed versus undisturbed forests, should be major determinants of viral composition.

Third, we focused on the difficulty to detect exhaustively the viral sequences of a virome by shotgun sequencing. The first step in characterising viral diversity is to produce a reliable inventory, which is currently done by taxonomic assignment of virome sequences. However, the analytical (concentration of viral particles, extraction method, random amplifications, sequencing method) and bioinformatics (for the production of contigs representing a virome) approaches introduce biases such as an over-representation of certain genomes and the formation of chimeric sequences composed of different organisms. To address this issue, we have developed a pipeline called « d-chimer » that allows taxonomic assignment of post-assembly sequences to optimise viral detection in viromics studies, including in chimeric contigs. This approach is based on two steps. First, a filter that takes into account the likelihood of the presence of chimeric sequences in the BLAST outputs expressed by different fractions of the query aligning with different reference sequences. Then, considering that not all parts of sequences are detected in this process at once, the uncovered areas are cut, stored and used as input for a new BLAST – filter cycle, in a recursive manner (recycling). The use of d-chimer in two successive steps of BLASTn and BLASTx significantly reduces the overall computational time, while allowing a better detection of viral fragments with a positive impact on richness compared to the « best-hit » approach. We applied d-chimer to assembled bird and rodent viral data. Compared to a one-step « best-hit » approach, both datasets show a significant increase in the number of viral contigs and contig fragments assigned. This gain in viral sequence numbers also revealed an increase in viral richness at the species and genus level and, to a lesser extent, at the family level.

All the results obtained during this thesis show that environmental components are key factors in viral diversity. Combined with the development of high-throughput molecular detection tools, the analysis of viral diversity in animal reservoirs should allow us to better study the ecology of viruses and their determinants. The comparison of viral metagenomic data obtained in animal reservoirs, vectors and humans should shed light on the links with zoonoses in French Guiana and elsewhere in Amazonian ecosystems where a significant part of viral diversity remains to be discovered and understood.