Inès LELEU

Les astrocytes, cellules cérébrales majoritaires, joueraient un rôle crucial dans la défense du cerveau dans les infections parasitaires en participant à la neuroinflammation. Dans le modèle de neuropaludisme expérimentale (NPE) induit chez la souris sensible C57BL/6 (CM^S) par l’infection à Plasmodium (P.) berghei ANKA (PbA), la physiopathologie résulterait de la séquestration d’hématies parasitées (GRp) dans les capillaires cérébraux, qui favoriserait une activation précoce des cellules gliales, et leur production précoce de cytokines et chimiokines pro-inflammatoire dont les chimiokines CXCL-10 (C-X-C motif chemokine ligand 10) et CCL-2 (chemokine ligand 2), l’interféron gamma (IFN-γ) et le facteur de nécrose tumorale TNF-α. Cette réponse inflammatoire favoriserait la migration dans le cerveau de lymphocytes T CD8⁺ exprimant le récepteur CXCR3 (C-X-C motif chemokine receptor 3) du CXCL-10. Au cours de ce travail de thèse, nous avons montré un transfert de microvésicules plasmodiales (PbA-MVs) des GRp aux astrocytes. L’objectif principal du projet consistait donc à : i) élucider les mécanismes intervenants dans le transfert des microvésicules plasmodiales dans l’astrocyte ; et ii) de caractériser les réponses fonctionnelles de l’astrocyte après transfert des PbA-MVs. Dans un modèle de primo-cultures d’astrocytes stimulées par des globules rouges parasités par PbA (GRp-PbA), nous avons mis en évidence l’implication d’une autophagie non-conventionnelle, appelée « LC3-associated Phagocytosis » (LAP), dans la prise en charge et la clairance définitive des PbA-MVs dans l’astrocyte. Ce transfert de PbA-MVs par la LAP serait impliqué dans l’induction d’une réponse pro-inflammatoire astrocytaire dont le CXCL-10 serait un acteur majeur. Le CXCL-10 est une chimiokine attractante des T CD8⁺CXCR3⁺ cytotoxiques, dont la production ferait intervenir la voie de signalisation TLR3-TRIF. L’analyse comparative des astrocytes dérivés de souris CM^S avec des astrocytes issus de souris résistante au NPE (CM^R), a permis de conclure que le rôle des astrocytes dans les processus inflammatoires était étroitement associé à la susceptibilité au NPE. Dans un second temps, nous avons évalué l’impact de cette autophagie des PbA-MVs sur les fonctions, à court et long terme, des astrocytes au cours de la pathologie en identifiant les signatures lipidomiques des astrocytes provenant des souris CM^S et CM^R après contact in vitro avec les GRp-PbA, comparativement aux astrocytes contrôles non stimulés. La capacité des astrocytes, après transfert des PbA-MVs par autophagie, à présenter des antigènes parasitaires aux lymphocytes T CD8⁺ qui migrent dans le cerveau des souris CM^S, a ensuite été analysé in vitro. Les résultats obtenus ont montré une augmentation significative de la prolifération lymphocytaire des T CD8⁺ isolés du cerveau des souris ayant développés un NPE, après contact avec des astrocytes contenant les microvésicules parasitaires. De plus, l’induction d’une sénescence des astrocytes, après autophagie des PbA-MVs, médiée par P21 a été mis en évidence. La senescence serait un des mécanismes qui participerait à l’induction de la réponse inflammatoire des astrocytes. Cet ensemble de résultats permet de suggérer fortement un rôle important des astrocytes dans la physiopathologie du NPE. Nous avons aussi observé une réponse anti-inflammatoire de l’astrocyte caractérisée par la production du LIF (leukemia inhibitory factor), du TGF-β (transforming growth factor beta) et de l’interleukine 10, démontrant un rôle duel de la cellule astrocytaire dans la neuropathogénèse associé au paludisme

Nous avons ensuite analysé l’impact de la modulation de la réponse inflammatoire des astrocytes dans le devenir de la pathogénèse dans un modèle de co-infection Toxoplasma–Plasmodium. La toxoplasmose induite par Toxoplasma gondii (Tg) sévissant dans les mêmes zones endémiques palustres, la co-infection avec Plasmodium est fréquente mais reste très peu étudiée. La toxoplasmose est une infection chronique, asymptomatique, qui en fonction des souches, peut se manifester par la présence de kystes de Tg (dans notre étude, souche de type II) dans le cerveau. La réponse immune dans le cerveau lors de l’infection par Tg présente des similitudes avec celle du NPE : migration de lymphocytes T CD8⁺ dans le cerveau, activation astrocytaire qui contrôlerait le parasite et l’inflammation, production des mêmes spectres de cytokines et chimiokines pro- et anti-inflammatoires, et recrutement des cellules lymphoïdes innées (ILCs) dans le cerveau. Nos résultats montrent que l’infection Tg de type II protège du NPE chez la souris CM^S infectée par PbA. La deuxième partie de mon travail de thèse a consisté à étudier le rôle des astrocytes dans la protection contre le NPE lors d’une co-infection avec Tg (Tg–PbA). Nous avons mis en évidence : 1) un changement phénotypique des astrocytes activés (exprimant la protéine acide fibrillaire gliale GFAP) qui produisent majoritairement du TGF-β (transforming growth factor beta), chez les souris infectées par Tg (phénotype A2) par rapport au CXCL-10 chez les NPE⁺ (phénotype A1) et un phénotype intermédiaire modérée A1/A2 chez les souris coinfectées Tg–PbA avec une production importante d’interleukine 33 (IL-33) par les astrocytes. L’IL-33 participerait au recrutement des ILC de type II (ILC2) dans le cerveau des souris coinfectées, et à la mise ne place d’un micro-environnement cérébral non favorable au développement du NPE. Nous avons étendu nos observations chez l’homme, sur des cohortes de patients mono- et coinfectées avec Tg et Plasmodium falciparum ou vivax en Guyane Française et des patients ayant développés un paludisme aigue ou neuropaludisme en Inde.

En conclusion, nous avons décrit un rôle majeur des astrocytes dans l’induction et dans le contrôle de la réponse inflammatoire qui contribue au paludisme sévère. Ce projet nous a permis de mettre en évidence des signatures qui pourraient être des biomarqueurs et/ou des cibles thérapeutiques pour les désordres neurologiques induits par une ou plusieurs infections parasitaires chez l’Homme.

Astrocytes, the majority of brain cells, play a crucial role in the defense of the brain in parasitic infections by participating in neuroinflammation. In experimental cerebral malaria (ECM) induced in the susceptible C57BL/6 mice (CM^S) by infection with Plasmodium (P.) berghei ANKA (PbA), the pathophysiology result from the sequestration of parasitic red blood cells (iRBCs) in the brain microvessels, that would promote early activation of glial cells, and their early production of pro-inflammatory cytokines and chemokines including chemokines CXCL-10 (C-X-C motif chemokine ligand 10) and CCL-2 (chemokine ligand 2), interferon gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor TNF-α. This inflammatory response promotes the migration of CD8⁺ T lymphocytes expressing the CXCR3 receptor (C-X-C motif chemokine receptor 3) in the brain. During this thesis work, we showed a transfer of plasmodial microvesicles (PbA-MVs) from iRBCs to astrocytes. The main objective of the project was therefore to: i) elucidate the mechanisms involved in the transfer of plasmodial microvesicles in the astrocyte; and ii) characterize functional responses of the astrocyte after PbA-MVs transfer. Using primary cultures of astrocytes stimulated by PbA-infected red blood cells (PbA-iRBCs), we described the involvement of an unconventional autophagy, called «LC3-associated Phagocytosis» (LAP), in the management and definitive clearance of PbA-MVs in the astrocyte. This transfer of PbA-MVs by LAP would be involved in the induction of an astrocytic pro-inflammatory response of which CXCL-10 would be a major player. CXCL-10 is a chemokine attractant of cytotoxic CD8⁺CXCR3⁺ T cells, whose production would involve the TLR3-TRIF signaling pathway. The comparative analysis of astrocytes derived from CM^S mice with astrocytes from ECM-resistant mice (CM^R), led to the conclusion that the role of astrocytes in inflammatory processes was closely associated with ECM susceptibility. In a second time, we evaluated the impact of this PbA-MVs autophagy on the astrocytes’ functions, at short and long term, during pathology by identifying the lipidomic signatures of astrocytes from CM^S and CM^R mice after in vitro contact with PbA-iRBCs, compared to unstimulated controlled astrocytes. The ability of astrocytes, undergoing PbA-MVs autophagy, to present parasitic antigens to CD8⁺ T cells that infiltrate the brain of CM^S mice, was then analyzed in vitro. The results showed a significant increase in lymphocytic proliferation of CD8⁺ T isolated from the brain of mice that developed an ECM, after contact with astrocytes containing parasitic microvesicles. Moreover, the induction of an astrocyte’ senescence, after autophagy of PbA-MVs, mediated by P21 was highlighted. Senescence would be one of the mechanisms that participate in the induction of the inflammatory response of astrocytes. This set of results strongly suggests an important role of astrocytes in the pathophysiology of ECM. We also observed an anti-inflammatory response of astrocyte characterized by the production of leukemia inhibitory factor (LIF), TGF-β (transforming growth factor beta) and interleukin 10, demonstrating a dual role of the astrocyte in malaria-associated neuropathogenesis.

Further, we analyzed the impact of the modulation of the inflammatory response of astrocytes in the fate of pathogenesis in a Toxoplasma–Plasmodium co-infection model. Toxoplasmosis induced by Toxoplasma gondii (Tg) occurring in the same malaria endemic areas, co-infection with Plasmodium is frequent but remains very little studied. Toxoplasmosis is a chronic, asymptomatic infection, which, depending on the strain, may be manifested by the presence of Tg cysts (in our study, type II strain) in the brain. The immune response in the brain during Tg infection shows similarities with that of ECM: migration of CD8⁺ T lymphocytes in the brain, astrocyte activation that would control the parasite and inflammation, production of the same pro-and anti-inflammatory cytokines and chemokines spectra, and recruitment of innate lymphoid cells (ILCs) into the brain. Our results show that type II Tg infection protects against ECM in CM^S mice infected with PbA. The second part of my thesis work consisted in studying the role of astrocytes in the protection against ECM during co-infection with Tg (Tg–PbA). We demonstrated: 1) a phenotypic change of activated astrocytes (expressing glial fibrillar acid protein GFAP) that mainly produce TGF-β (transforming growth factor beta), in mice infected with Tg (phenotype A2) compared to CXCL-10 in ECM⁺ (phenotype A1) and a moderate intermediate phenotype A1/A2 in Tg-PbA coinfected mice with significant production of interleukin 33 (IL-33) by astrocytes. IL-33 would be involved in the recruitment of type II ILC (ILC2) into the brains of co-infected mice, and in the establishment of a brain microenvironment that is not conducive to the development of ECM. We extended our observations in humans, on cohorts of mono- and co-infected patients with Tg and Plasmodium falciparum or vivax in French Guiana and patients who developed acute or cerebral malaria in India.

In conclusion, we described a major role of astrocytes in the induction and control of the inflammatory response that contributes to severe malaria. This project allowed us to highlight signatures that could be biomarkers and/or therapeutic targets for neurological disorders induced by one or more parasitic infections in humans.